琥珀酸脱氢酶抑制剂类（sdhis）杀菌剂的研究进展 | 研发生产 | 文章中心 | 农药资讯网-凯发娱发k8

       原文链接：http://www.nyxxb.cn/cn/article/doi/10.16801/j.issn.1008-7303.2019.0095

       随着科技的发展，保护农作物安全的方法越来越多，如：转基因工程、生物农药等，但由于其发展速度较缓，且存在很多不可控因素，在未来几十年内，化学农药仍然在确保粮食安全上起着不可替代的作用。按照防治对象分类，化学农药主要分为除草剂、杀虫剂和杀菌剂等，其中杀菌剂市场最小，品种最少，但由于转基因技术的发展，特别是复合型转基因作物的普及，使得除草剂和杀虫剂市场受到限制，杀菌剂市场发展迅速，其中以琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，sdh）为靶标的杀菌剂发展最为迅速。2016 年，琥珀酸脱氢酶抑制剂类（sdhis）杀菌剂的全球销售额为16.91亿美元，占564.52亿美元全球农药市场的3.0%，占152.68亿美元杀菌剂（包括非作物用杀菌剂）市场的11.1%。2011—2016年其复合增长率最高（23.8%），超过了甲氧基丙烯酸酯类及三唑类等老牌杀菌剂，因此，sdhis杀菌剂成为备受全球瞩目的“一匹黑马”。本文重点描述了靶向sdhis杀菌剂的发展脉络、作用机理、构效关系及抗性情况分布，旨在为新型sdhi的设计奠定基础。

1  sdhis杀菌剂的发展脉络

       靶向琥珀酸脱氢酶的第1个商品化杀菌剂萎锈灵是由美国有利来路（现科聚亚）公司于1969年开发上市的品种，萎锈灵有良好的内吸传导性，一般用于种子处理剂来防治禾谷类黑穗病，以及叶面喷雾方式防治禾谷锈病，萎锈灵的诞生同时也标志着杀菌剂从保护性杀菌剂向内吸性杀菌剂的方向发展。至今，sdhis杀菌剂经历了50年的发展，其杀菌谱不断拓展，已从最早期的种子处理，扩展到水稻病害的防治，再拓展到现在用于大田作物、果蔬、经济作物以及观赏类植物病害的防治。本部分将以sdhis杀菌剂的杀菌谱为主线进行阐述。

       1975年，美国有利来路公司基于萎锈灵又成功报道了氧化萎锈，主要用于防治锈病。此后，很多公司开始参与其中，如日本组合化学、日本农药、巴斯夫、壳牌 (现拜耳)、住友化学、孟山都及先正达等10余家，相继开发出灭锈胺（1981年，日本组合化学）、氟酰胺（1986年，日本农药）、麦锈灵（1986年，巴斯夫）、甲呋酰胺（1974年，壳牌）和呋吡菌胺（1997年，住友化学），但这些品种的杀菌谱均较窄，大多用于种子处理。

       直到1997年，由孟山都公司开发出噻呋酰胺，它具有比较强的内吸传导性及较长的持效性，针对很多病害都有良好的防治效果，是长久以来被用于防治水稻纹枯病的良药，但其在其他作物病害方面的利用极少，效果也并不显著。噻呋酰胺命途多舛，首次由孟山都研制成功，1994年卖与罗门哈斯并进行生产，2001年罗门哈斯并入美国陶氏益农公司，此后又被日产化学获得，经历了几番变故，同时考虑其成本问题，且水稻纹枯病主要集中在中国和印度，在东南亚地区纹枯病发病并不严重，日产化学对其推广并不成功。因此必须在控制成本的前提下拓宽杀菌谱，争取用于更多作物病害的防治。

       令人欣喜的是，2003年由巴斯夫创制的啶酰菌胺横空出世，这也是史上第1个广谱性的sdhis杀菌剂，仅仅上市2年，销量便以惊人的速率增加，一举步入上亿美元的产品之列。不同于早期开发的萎锈灵，啶酰菌胺杀菌谱很广，几乎对于所有类型的真菌病害都有防效，主要用于白粉病、褐腐病、叶斑病、灰霉病、菌核病以及由链格孢菌等引起的病害的防治，并且对其他药剂已产生抗性的菌株也有效。啶酰菌胺具有优异的预防作用，并有一定的治疗效果，2007年便已用于上百种作物上防治多种病害，成为巴斯夫公司炙手可热的产品，即便到了现在，啶酰菌胺的销售额也是前3名，这也一举让巴斯夫成为sdhis杀菌剂的领头羊。至此，sdhis杀菌剂家族真正受到全球行业内各大农药公司的广泛关注。随后巴斯夫公司在对啶酰菌胺进一步优化中又发现了一重磅产品——氟唑菌酰胺（2011年，巴斯夫），它也是sdhis杀菌剂，具有很好的预防和治疗活性，用于防治广谱的真菌病害，可用于近百种作物，如谷类作物、豆类蔬菜、油料作物和花生等，氟唑菌酰胺具有高效、广谱、持效性强、选择性强等特点，同时还具有优异的内吸传导性，耐雨水冲刷，其于2011年上市，2012年便取得了近1亿美元的销售额，此后销量逐年增加，2015年其销售额也首次超过了啶酰菌胺，达到了3.9亿美元，成为了sdhis杀菌剂中当之无愧的王者。

       巴斯夫公司开创性的研究，使sdhis得到了空前的发展，此后高效广谱性的sdhis杀菌剂的发展犹如雨后春笋般涌现，联苯吡菌胺（2011 年，拜耳）、氟唑环菌胺（2011年，先正达）、氟唑菌苯胺（2012年，拜耳）、氟吡菌酰胺（2012年，拜耳）、苯并烯氟菌唑（2012年，先正达）、异丙噻菌胺（2015年，日本石原）、氟唑菌酰羟胺（2016年，先正达）、pyraziflumid（2018年，日本农药）及isoflucypram（预计2020 年上市，拜耳）等陆续被创制并推向市场。2017年，本课题组通过药效团连接碎片的虚拟筛选方法成功得到了用于水稻纹枯病防治的广谱性农药候选化合物氟苯醚酰胺以及氯苯醚酰胺。

       随着越来越多的科研工作者参与到sdhis杀菌剂的农药创制中，如今琥珀酸脱氢酶已经是不可忽视的重要杀菌剂靶标，可以预见，未来广谱高效sdhis杀菌剂必将成为杀菌剂的主导。

2  sdhis杀菌剂的作用机制

       琥珀酸脱氢酶又称线粒体呼吸链复合体ⅱ（ec1.3.5.1），它是三羧酸循环的功能部分，与线粒体电子传递链相连，催化从琥珀酸氧化到延胡索酸和从泛醌还原到醌的偶联反应；它由4个亚单位共同组成：黄素蛋白（fp，含1个共价结合的fad辅因子）、铁硫蛋白（ip，含3个铁硫中心）和另外2种嵌膜蛋白（大的细胞色素结合蛋白cytbl和小的细胞色素结合蛋白cytbs）（图1a）。fp和ip组成该复合体的可溶部分，具有琥珀酸脱氢酶活性；cytbl和cytbs两种嵌膜蛋白将fp、ip固定在内膜上，且具有泛醌还原酶活性。sdhi类杀菌剂就是通过完全或者部分占据底物泛醌的位点，抑制了电子从琥珀酸到泛醌的传递，从而阻断了病原菌的能量代谢，抑制病原菌的生长、导致其死亡，最终达到防治植物病害的目的。

       近年来，关于sdh的结构生物学研究取得了重要进展。iverson等最早于1999年解析了大肠杆菌escherichia coli qfr（quinol: fumarate oxidoreductase）的三维结构（0.33 nm）；同年11月，lancaster 等解析了wolinella succinogenes中qfr 的三维结构（0.22 nm）；2003年，iwata领导的小组获得了分辨率更高的大肠杆菌sdh的晶体结构（0.26 nm）；2005年，饶子和研究组首次报道了猪心sdh的晶体结构 （0.24 nm）以及结合有抑制剂3-硝基丙酸盐（3-npa）、ttfa的复合物晶体结构（0.35 nm）。同年，berry 研究组报道了目前解析度最高的鸡心sdh的结构（pdb code: 2fbw, 0.21 nm）。研究表明，sdh存在一个qp结合位点，商品化杀菌剂萎锈灵（carboxin）即结合在该位点上（图1b）。

图1  a. 鸡心sdh的三维结构显示图；b. carboxin与sdh结合方式显示图；c. boscalid与sdh结合方式显示图

       随后，我们基于已有的晶体学数据和生物学数据，对10个商品化杀菌剂与sdh的作用机制进行研究，发现该类抑制剂的酸部分插入了活性腔底部，与c_r46形成离子-π相互作用，酰胺键中氧原子与b_w173和d_y91形成hbond，胺部分伸向活性腔口部分，如图1c所示，boscalid中胺部分的联苯结构伸向活性腔口，与c_w35形成π-π相互作用。

3  sdhis杀菌剂的构效关系

       目前已经上市的sdhi的化学结构中无一“缺席”酰胺键，所以又称为酰胺类杀菌剂，其化学结构中主要包含羧酸部分、酰胺键部分和胺部分（图式1）。

       纵观目前已有的sdhis杀菌剂，其中不难发现，羧酸部分历经50年改变并不大，主要为氧硫杂环己二烯、苯基、呋喃、噻吩和吡唑等，其中羧酸部分为吡唑的商品化品种就有11个之多，吡唑环的引入大大增强了其活性，如氟唑菌酰胺、苯并烯氟菌唑和氟唑菌酰羟胺等。近年来，全球各大农药公司也在对酸部分进行改造，其中一个值得注意的商品化品种是由日本株式会社公司开发的pyraziflumid，其创新点在于羧酸部分引入了吡嗪片段，主要用于水稻、果树、蔬菜和草坪等防治白粉病、黑星病、灰霉病、菌核病、轮纹病、果斑病和币斑病等。pyraziflumid的成功开发说明了羧酸部分也是一个重要的突破点。目前中国也有很多对羧酸部分进行改造的案例，虽然结果并不太理想，但仍然是一个值得考虑的方向，若能成功开发出新的羧酸部分，在如今激烈的竞争中必将有一席之地。

图式1  商品化的琥珀酸脱氢酶抑制剂类（sdhis）杀菌剂的基本骨架

       与此同时，羧酸部分氟原子的引入有利于提高化合物的生物活性，在23个商品化品种中，其中有19个品种的酸部分含有氟原子，主要由于其具有较小的原子半径、高的电负性、碳-氟键能高（使得含氟化合物虽然能够参与代谢过程，但是又具有明显的抗代谢性）、增加有机分子的亲脂性（使得含氟化合物在生物体内对膜、组织的穿透能力增强，提高了含氟化合物在生物体内的吸收和传输速度）。基于以上优点，氟原子在药物设计中承担着改变分子稳定性、亲脂性、酸碱性和构型等重要作用，这在sdhis杀菌剂中也同样表现的抢眼。本课题组在前期工作中，同样在吡唑羧酸部分引入了二氟甲基和三氟甲基，构效关系研究表明：二氟甲基取代的化合物的活性优于三氟甲基，主要是由于二氟甲基的引入，可与d_d90氨基酸残基形成氢键或形成分子内氢键，使得其与琥珀酸脱氢酶的结合自由能优于三氟甲基。

       早期的研究表明，酰胺键是较为保守的，如萎锈灵、啶酰菌胺和联苯吡菌胺等，但是直到2016年先正达开发上市了氟唑菌酰羟胺，其n原子上进行了甲氧基取代，这是先正达公司开发的又一个“重磅炸弹”，其广谱且高效，适用于多种作物。先正达指出，在所有化学类型的产品中，氟唑菌酰羟胺对叶斑病和白粉病的活性最高，而这两种病害又是农业生产中最常见的病害；另外氟唑菌酰羟胺对难以防治的病害，如葡萄孢菌（botrytis spp.）、核盘菌（sclerotinia spp.）和棒孢菌（corynespora spp.）等病原菌引起的病害也有较好的防效；氟唑菌酰羟胺还突破性地防治谷物上由镰刀菌（fusarium）引起的病害，如赤霉病等。紧随其后，拜耳公司对酰胺键中n上取代基进行优化，发现n原子进行环丙基取代时可以有效地提高化合物活性，并成功开发了isoflucypram，这也标志着新型sdhis杀菌剂已经开始诞生，其开发空间依然广阔无比。

       对于胺部分的结构改造，如早期的萎锈灵和氧化萎锈灵，其胺部分仅为一个苯环，对其进行修饰程度有限，造成病害防治上比较单一，杀菌谱相对较窄。2003年后，人们开始对胺部分进行系统优化，增大了抑制剂的体积，使其能够更好地与活性空腔结合，达到更好的抑制效果，如啶酰菌胺、联苯吡菌胺（胺部分为联苯）和苯并烯氟菌唑（胺部分为并环）。因此总体来说，胺部分的设计策略大致有3种（图式2）：并环策略（苯并烯氟菌唑）、联苯策略（氟唑菌酰胺）和延长链长的策略（氟吡菌酰胺）。通过这3 种策略，各大农药公司相继开发出众多具有广谱高效的杀菌剂，如啶酰菌胺、氟唑菌酰胺、呋吡菌胺、联苯吡菌胺、吡唑萘菌胺、苯并烯氟菌唑、氟吡菌酰胺等，创造了sdhis杀菌剂的辉煌，也奠定了sdhis杀菌剂在整个杀菌剂市场中的地位。

图式2  sdhis杀菌剂一般设计策略

       从防治的病害上来说，sdhis杀菌剂的杀菌谱已经很广，几乎覆盖所有的真菌病害，如：灰霉病、白粉病、纹枯病、赤霉病和锈病等，但在目前已上市的品种中，均没有对黄瓜霜霉病等卵菌有较高防效的品种出现，这是令人遗憾的，也是令人期待的，未来若能够开发出可以有效防治卵菌病害的新品种，必定会成为该领域发展史上的又一个重要里程碑。

4  sdhis杀菌剂的抗性

       由于靶标的作用位点单一，杀菌剂抗性行动委员会（fungicides resistance action committee，frac）将sdhis杀菌剂归为中等至高抗性风险，目前已有10多种病原菌对sdhis杀菌剂存在抗性。表1统计了截止2019年所报道的抗性位点及其物种来源，其中b_h267y（等位于2fbw中b_h216）是一个抗性频率较高的抗性位点，几乎存在于所有的物种中。

表1  对sdhis杀菌剂产生抗性的真菌物种、来源及突变体

       如图2所示，以2fbw为基准，显示了部分突变氨基酸残基在活性腔q p中的分布情况，b_h216与抑制剂没有形成直接的相互作用，同时表1所统计的抗性位点与抑制剂的距离不等，可以大致分为：活性腔内抗性位点（如b_h216、b_p169、c_s39、c_i40）和活性腔外抗性位点（如b_t217、c_h105、c_h42、d_d57、b_r214）。本课题组前期关于b_h216y的抗性机制进行了研究，结果显示：当216号组氨酸突变成酪氨酸时，将破坏野生型中的氢键网络，使得抑制剂与受体的结合力减弱，进而产生抗性（数据未发表）。

       随着sdhis杀菌剂的广泛使用，抗性问题必然发生，这也警示我们在农业生产中，必须控制其使用的次数及用药的方式，以减缓抗性的发生。目前，sdhis杀菌剂均在同一交互抗性组，随着抗性的逐渐产生，未来可能有些品种还未上市便已产生抗性，这也为未来的设计提出了巨大的挑战。

图2  部分抗性位点在活性腔qp中的分布情况(残基编号为2fbw中编号)

5  sdhis杀菌剂未来发展的前景

       由于其作用位点单一，抗性风险的不断扩大，关于sdhis杀菌剂的复配产品必将是未来重点之一，此外，sdhis杀菌剂早期是从防治锈病开始的，其对于担子菌引起的病害防效优异，随着几十年的发展，新型sdhis杀菌剂已经从担子菌转向了各种病菌的防治，如子囊菌、半知菌等，杀菌谱正在不断扩大，但令人遗憾的是，对于卵菌纲的病害，如黄瓜霜霉病、马铃薯晚疫病、辣椒疫霉病等，该类抑制剂均未表现出优异的防效，这或许是未来sdhis杀菌剂发展的另一重点，这可能需要更加新颖且有别于现有结合模式的结构诞生。